HXK II CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400611-ACT

Das humane Gen HK2 kodiert Hexokinase II (HXK II), ein mitochondrienassoziiertes Enzym, das die ATP-abhängige Phosphorylierung von Glukose zu Glukose-6-phosphat katalysiert und damit Glukose unwiderruflich der Glykolyse sowie verwandten biosynthetischen Stoffwechselwegen zuführt. Durch die Kopplung des glykolytischen Flusses an den mitochondrialen Stoffwechsel beeinflusst HXK II die zelluläre Energiehomöostase, das Redoxgleichgewicht und die Bereitstellung anaboler Vorstufen, die in den Pentosephosphatweg sowie in die Nukleotid- und Lipidsynthese einfließen. Eine erhöhte HK2-Expression und eine umprogrammierte Glykolyse werden häufig in proliferativen und stressadaptierten Zuständen beobachtet, was HXK II mit der metabolischen Reprogrammierung in der Krebsbiologie, der Aktivierung von Immunzellen und hypoxieresponsiver Signalgebung verknüpft. Veränderte HK2-Aktivität wurde zudem in insulinresponsiven Geweben und bei Mechanismen metabolischer Erkrankungen beschrieben, weshalb HK2 ein häufig genutzter Ansatzpunkt ist, um Glukoseverwertung und das mitochondriale–metabolische Zusammenspiel zu untersuchen.

HXK II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HXK II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HXK II-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HXK II-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HXK II-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.