HSPA8/HSC70 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418508-ACT

HSPA8 codifica a proteína cognata de choque térmico de 71 kDa (HSC70), uma chaperona da família HSP70 expressa constitutivamente, que sustenta a proteostase ao mediar, de forma dependente de ATP, o dobramento, o redobramento e o tráfego de proteínas clientes. A HSC70 participa da endocitose mediada por clatrina, da autofagia mediada por chaperona por meio do reconhecimento de LAMP2A e de vias de controle de qualidade proteica ligadas ao sistema ubiquitina–proteassoma e à dinâmica de grânulos de estresse. Ao regular o manuseio de polipeptídeos nascentes, a importação de proteínas para organelas e redes de chaperonas e cocaperonas, a HSPA8 influencia a sobrevivência celular sob estresse proteotóxico e metabólico. A desregulação da proteostase centrada em HSC70 está implicada em neurodegeneração, na adaptação de células cancerosas ao estresse e na biologia de infecções virais, tornando a HSPA8 um nó útil para estudos mecanísticos de vias de estresse e tráfego intracelular.

HSPA8/HSC70 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HSPA8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HSPA8/HSC70 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HSPA8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HSPA8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HSPA8/HSC70. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HSPA8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HSPA8/HSC70 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HSPA8/HSC70 em células tumorais com expressão de HSPA8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.