Plasmide CRISPR d'Activation (h) Histone H2A.X: sc-400538-ACT

H2AFX code la variante d’histone H2A.X, un composant essentiel de la chromatine qui est rapidement phosphorylé sur la sérine 139 (γH2AX) en réponse aux cassures double brin de l’ADN. Cette modification sert de point d’ancrage à la signalisation de la réponse aux dommages de l’ADN en recrutant des médiateurs et des facteurs de réparation, en coordonnant les voies kinasiques ATM/ATR, le remodelage de la chromatine, l’activation des points de contrôle (checkpoints) et la réparation par jonction d’extrémités non homologues et recombinaison homologue. La dynamique de H2A.X influence la tolérance au stress de réplication, la stabilité des télomères et des programmes transcriptionnels à l’échelle du génome liés à l’intégrité de la chromatine. Le dérèglement de la signalisation associée à H2AFX est fréquemment étudié dans des contextes d’instabilité génomique, de stress oncogénique et de sensibilité aux expositions génotoxiques.

Histone H2A.X Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de H2AFX sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Histone H2A.X Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus H2AFX dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription H2AFX, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Histone H2A.X. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus H2AFX natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Histone H2A.X au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Histone H2A.X dans les cellules tumorales présentant une expression de H2AFX silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.