Plásmido CRISPR de Activación (h) HIF PHD2: sc-403334-ACT

EGLN1 codifica HIF PHD2, una hidroxilasa de prolina dependiente de 2-oxoglutarato/Fe(II) que hidroxila las subunidades HIF-α en normoxia, lo que permite su reconocimiento por von Hippel–Lindau (VHL) y su degradación por el proteasoma. A través de esta vía de detección de oxígeno, HIF PHD2 modula programas transcripcionales que controlan la angiogénesis, la eritropoyesis, el metabolismo glucolítico, la adaptación mitocondrial y la supervivencia celular durante el estrés hipóxico. La actividad alterada de EGLN1/PHD2 influye en la magnitud de la señalización de HIF y se ha vinculado a fenotipos de adaptación a la hipoxia y a enfermedades caracterizadas por una homeostasis del oxígeno desregulada, incluida la biología del cáncer, la remodelación vascular pulmonar y mecanismos relacionados con la eritrocitosis. Como nodo central en la detección celular de oxígeno, EGLN1 se estudia ampliamente por sus efectos sobre redes génicas inducibles por hipoxia y la reprogramación metabólica.

HIF PHD2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EGLN1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HIF PHD2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EGLN1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EGLN1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HIF PHD2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EGLN1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HIF PHD2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HIF PHD2 en células tumorales con expresión de EGLN1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.