HEL308 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404447-ACT

HELQ kodiert die humane DNA-Helikase HEL308, eine ATP-abhängige SF2-Helikase, die zur Auflösung blockierter DNA-Replikationszwischenprodukte beiträgt und während Replikationsstress die Genomstabilität fördert. HEL308 ist an Signalwegen beteiligt, die mit DNA-Reparatur und der Verarbeitung von Replikationsgabeln verknüpft sind, einschließlich Mechanismen mit Schnittstellen zur homologen Rekombination und zum Fanconi-Anämie-Netzwerk für die Toleranz von Interstrang-Quervernetzungen. Durch die Unterstützung einer korrekten DNA-Replikation und der Signalübertragung der DNA-Schadensantwort beeinflusst HELQ zelluläre Ergebnisse wie die Aktivierung von Checkpoints, die chromosomale Integrität und das Überleben unter genotoxischem Stress. Eine veränderte Funktion oder Expression von HELQ wurde in der Literatur mit Phänotypen genomischer Instabilität und mit Suszeptibilitätskontexten in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und DNA-Reparatur-assoziierte Erkrankungen relevant sind.

HEL308 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HELQ-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HEL308 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HELQ-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HELQ-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HEL308-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HELQ-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HEL308-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HEL308-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HELQ-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.