HEATR5B Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-412293-LAC-2

Il gene umano HEATR5B codifica una proteina contenente ripetizioni HEAT, ritenuta funzionare da impalcatura per interazioni proteina–proteina che supportano l’assemblaggio coordinato di complessi macromolecolari e l’organizzazione intracellulare. Sulla base della biologia conservata delle ripetizioni HEAT, ci si aspetta che HEATR5B influenzi processi quali il trasporto nucleo-citoplasmatico, la dinamica del citoscheletro e la regolazione di vie di segnalazione e di percorsi legati al ciclo cellulare, modulando la localizzazione e la stabilità delle proteine partner. Un’espressione alterata o varianti in fattori di impalcatura con ripetizioni HEAT sono spesso associate a una proteostasi compromessa e a risposte di stress cellulare, meccanismi rilevanti per la biologia delle malattie proliferative e del neurosviluppo. I modelli di perturbazione di HEATR5B sono quindi utili per interrogare la connettività delle vie, mappare le reti di interazione e valutare le conseguenze trascrittomiche e fenotipiche a valle in sistemi cellulari umani.

Le particelle di attivazione lentivirale HEATR5B (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di HEATR5B in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale HEATR5B (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione HEATR5B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di HEATR5B. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo HEATR5B e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.