Plásmido CRISPR de Activación (m) HE4: sc-426693-ACT

Mouse Wfdc2 codifica HE4, una glucoproteína secretada que contiene un dominio de proteína ácida del suero (WAP), implicada en la regulación de proteasas extracelulares y en la homeostasis de las células epiteliales. HE4 está vinculada a la remodelación de la matriz pericelular y a la modulación de la señalización inflamatoria, procesos que influyen en la arquitectura tisular, la función de barrera y la comunicación célula–célula. En sistemas experimentales, la alteración de la expresión de HE4 se asocia con cambios en los programas de proliferación, migración y diferenciación en compartimentos epiteliales. Estas características hacen de Wfdc2 una herramienta molecular útil para estudiar la proteostasis en la superficie celular y la interrelación de vías entre factores secretados y respuestas transcripcionales intracelulares.

HE4 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Wfdc2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HE4 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Wfdc2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Wfdc2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HE4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Wfdc2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HE4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HE4 en células tumorales con expresión de Wfdc2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.