G_{α s} CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400476-ACT

GNAS kodiert die stimulierende Alpha-Untereinheit des G-Proteins, Gα s, einen zentralen Vermittler der GPCR-Signalübertragung, der die Adenylylcyclase aktiviert, den intrazellulären cAMP-Spiegel erhöht und PKA- sowie CREB-abhängige Transkriptionsprogramme in Gang setzt. Über diese Signalwege reguliert Gα s die Hormonantwort, die metabolische Kontrolle und die Differenzierung in unterschiedlichen Geweben und integriert Signale von Rezeptoren für Katecholamine, Glukagon und viele Peptidhormone. Zudem unterliegt GNAS einer komplexen genomischen Prägung (Imprinting), die gewebespezifische Dosiseffekte und ein Ungleichgewicht in der Signalübertragung hervorrufen kann. Eine dysregulierte GNAS/Gα s-Signalgebung ist mit endokrinen und skelettalen Erkrankungen assoziiert und wurde in mehreren Tumorkontexten mit einer onkogenen Aktivierung des cAMP-Signalwegs in Verbindung gebracht.

Gα s Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GNAS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gα s Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GNAS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GNAS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gα s-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GNAS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gα s-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gα s-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GNAS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.