GPRC6A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403492-ACT

GPRC6A codifica um receptor acoplado à proteína G da classe C implicado na deteção de nutrientes e na comunicação cruzada endócrino-metabólica, respondendo a sinais extracelulares como aminoácidos básicos e catiões divalentes. Ao acoplar-se a proteínas G heterotriméricas, o GPRC6A pode modular a sinalização de segundos mensageiros e vias de cinases a jusante que influenciam o metabolismo celular, a secreção hormonal e o tónus inflamatório. A sua atividade tem sido estudada em contextos como a homeostase da glicose, o equilíbrio energético e a sinalização osteoendócrina, ligando a sinalização dependente do receptor à biologia metabólica e esquelética. Alterações na expressão ou na sinalização do GPRC6A têm sido associadas na literatura a fenótipos complexos de doença relevantes para a obesidade, a diabetes tipo 2 e características cardiometabólicas, sustentando a sua utilização em estudos mecanísticos de vias.

GPRC6A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GPRC6A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPRC6A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GPRC6A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GPRC6A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPRC6A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GPRC6A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPRC6A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPRC6A em células tumorais com expressão de GPRC6A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.