GPR54 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403766-ACT

KISS1R (GPR54) ist ein GPCR der Klasse A, der an Kisspeptine bindet, die von KISS1 kodiert werden, und so die neuroendokrine Steuerung des Pubertätsbeginns sowie die Funktion der Reproduktionsachse reguliert. Nach Ligandenbindung koppelt GPR54 hauptsächlich an Gαq/11 und aktiviert dadurch die Phospholipase‑C-Signalgebung, die IP3‑abhängige Kalziummobilisierung sowie nachgeschaltete MAPK/ERK‑ und PKC‑Signalwege, die die Genexpression und die zelluläre Erregbarkeit beeinflussen. Dieser Signalknoten ist zentral für die Aktivierung hypothalamischer GnRH‑Neurone und integriert entwicklungsbedingte, metabolische und Umwelt‑Einflüsse, die die Gonadotropinfreisetzung feinabstimmen. Eine veränderte KISS1R‑Aktivität oder ‑Expression wird mit Störungen des Pubertätszeitpunkts und hypogonadotropem Hypogonadismus in Verbindung gebracht; zudem werden Störungen des GPR54‑Signalwegs auch im Kontext hormonabhängiger Tumorbiologie und zellulärer Migrationsprogramme untersucht.

GPR54 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KISS1R-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPR54 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KISS1R-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KISS1R-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPR54-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KISS1R-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPR54-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPR54-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KISS1R-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.