GPR43 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401858-ACT

FFAR2 codifica o receptor de ácidos graxos de cadeia curta GPR43, um GPCR que detecta acetato, propionato e butirato derivados do metabolismo microbiano intestinal. Quando ativado, o GPR43 acopla-se principalmente às vias de sinalização Gi/o e Gq para modular o AMPc, o fluxo de cálcio intracelular e vias MAPK a jusante, influenciando a quimiotaxia de leucócitos, a produção de citocinas e as respostas da barreira epitelial. Esse receptor participa do diálogo imunometabólico em superfícies mucosas e no tecido adiposo, conectando a disponibilidade de nutrientes ao tônus inflamatório. Alterações na sinalização FFAR2/GPR43 têm sido associadas a distúrbios inflamatórios e desregulação metabólica, tornando-o relevante para o estudo das interações hospedeiro–microbioma e de vias da imunidade inata.

GPR43 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FFAR2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR43 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FFAR2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FFAR2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR43. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FFAR2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR43 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR43 em células tumorais com expressão de FFAR2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.