GPR35 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416792-ACT

GPR35 kodiert einen G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor der Klasse A, der in Immun- und gastrointestinalen Geweben besonders stark exprimiert wird und an heterotrimere G‑Proteine koppelt, um die intrazelluläre Second‑Messenger‑Signalübertragung zu regulieren. Zu den beschriebenen Liganden zählen kleine Moleküle, die mit Mikrobiom und Stoffwechsel assoziiert sind, wodurch GPR35 als Sensor positioniert wird, der Umweltreize mit zellulären Antworten verknüpft. Nachgeschaltete Signalwege umfassen häufig die Modulation von cAMP, Ca²⁺‑Flüssen und ERK/MAPK‑Signalgebung, mit Auswirkungen auf Chemotaxis, Barrierefunktion und die Produktion inflammatorischer Mediatoren. Eine veränderte GPR35‑Expression oder ‑Signalübertragung wurde mit einer erhöhten Anfälligkeit für entzündliche Darmerkrankungen sowie breiteren immunmetabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für Studien zur mukosalen Immunität und Entzündung unterstreicht.

GPR35 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPR35-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPR35 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPR35-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPR35-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPR35-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPR35-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPR35-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPR35-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPR35-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.