GP78 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402346-ACT

AMFR codifica a GP78 humana (receptor do fator de motilidade autócrino), uma ligase E3 de ubiquitina ancorada no retículo endoplasmático (RE) que atua como componente central da degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD), ao ubiquitinar proteínas mal dobradas para eliminação pelo proteassoma. A GP78 coopera com chaperonas do RE e enzimas E2 para regular o controle de qualidade proteica, as respostas ao estresse do RE e a renovação de reguladores metabólicos e de sinalização selecionados. Por meio de seus papéis na proteostase dependente de ubiquitina e na sinalização associada à membrana, a atividade de AMFR/GP78 tem sido associada a programas de adaptação celular que influenciam proliferação, migração e sinalização de estresse inflamatório. A desregulação do ERAD e de redes de ligases de ubiquitina envolvendo a GP78 tem sido estudada em contextos como biologia do câncer, neurodegeneração e modelos de doenças metabólicas, nos quais o desequilíbrio da proteostase é um fator contribuinte.

GP78 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AMFR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GP78 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AMFR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AMFR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GP78. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AMFR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GP78 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GP78 em células tumorais com expressão de AMFR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.