Plásmido CRISPR de Activación (h) GP78: sc-402346-ACT

AMFR codifica la proteína humana GP78 (receptor del factor de motilidad autocrina), una ligasa E3 de ubiquitina anclada al retículo endoplásmico (RE) que funciona como un componente central de la degradación asociada al retículo endoplásmico (ERAD), al ubiquitinar proteínas mal plegadas para su eliminación por el proteasoma. GP78 coopera con chaperonas del RE y enzimas E2 para regular el control de calidad proteico, las respuestas al estrés del RE y el recambio de determinados reguladores metabólicos y de señalización. A través de sus funciones en la proteostasis dependiente de ubiquitina y la señalización asociada a membrana, la actividad de AMFR/GP78 se ha vinculado a programas de adaptación celular que influyen en la proliferación, la migración y la señalización de estrés inflamatorio. La desregulación de ERAD y de redes de ligasas de ubiquitina que involucran a GP78 se ha estudiado en contextos como la biología del cáncer, la neurodegeneración y modelos de enfermedades metabólicas, donde el desequilibrio de la proteostasis es un factor contribuyente.

GP78 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AMFR sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GP78 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AMFR en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AMFR, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GP78. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AMFR y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GP78 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GP78 en células tumorales con expresión de AMFR silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.