GP-39 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402147-ACT

CHI3L1 kodiert das Glykoprotein GP-39 (YKL-40), ein sezerniertes chitinaseähnliches Protein, dem zwar die enzymatische Chitinase-Aktivität fehlt, das jedoch den Umbau der extrazellulären Matrix, die Zelladhäsion und entzündliche Signalwege moduliert. GP-39 wird von Makrophagen, Neutrophilen, Fibroblasten sowie verschiedenen stromalen und epithelialen Kompartimenten produziert und beeinflusst Chemotaxis, angiogene Programme und Gewebereparaturreaktionen. Es wird häufig in Signalwegen untersucht, die mit der Aktivierung der angeborenen Immunantwort, Zytokinnetzwerken und fibrotischem Remodeling verbunden sind, einschließlich MAPK/ERK-, PI3K/AKT- und NF-κB-assoziierter transkriptioneller Antworten. Eine veränderte CHI3L1/GP-39-Expression wird mit chronischer Entzündung, Fibrose und der Biologie des tumorassoziierten Mikromilieus in Verbindung gebracht und ist damit relevant für mechanistische Studien zur Immun–Stroma-Kommunikation und zur Dynamik der extrazellulären Matrix.

GP-39 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHI3L1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GP-39 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHI3L1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHI3L1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GP-39-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHI3L1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GP-39-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GP-39-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHI3L1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.