GnT-I CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409648-ACT

MGAT1 kodiert die N‑Acetylglucosaminyltransferase I (GnT‑I), ein Enzym des medialen Golgi-Apparats, das den ersten festgelegten Schritt bei der Umwandlung von High‑Mannose‑ in komplexe und hybride N‑Glykane katalysiert. Indem GnT‑I die Verzweigung der N‑gebundenen Glykosylierung einleitet, beeinflusst es die Proteinfaltung, Stabilität, den Rezeptortransport sowie Zell‑Zell‑ und Zell‑Matrix‑Interaktionen bei sekretorischen und membranständigen Proteinen. Das MGAT1‑abhängige Glykan‑Remodeling ist in Golgi‑Verarbeitungswege eingebunden und moduliert Signalausgänge von Glykoproteinen, die an Adhäsion und der Reaktionsfähigkeit auf Wachstumsfaktoren beteiligt sind. Eine fehlregulierte MGAT1‑Aktivität und veränderte N‑Glykanstrukturen werden häufig im Kontext der Krebsbiologie, der Immunregulation und angeborener Glykosylierungsstörungen als mechanistische Ursachen aberranter zellulärer Phänotypen untersucht.

GnT-I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MGAT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GnT-I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MGAT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MGAT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GnT-I-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MGAT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GnT-I-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GnT-I-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MGAT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.