GlyRS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404105-ACT

GARS kodiert die menschliche Glycyl‑tRNA‑Synthetase (GlyRS), eine zytosolische Aminoacyl‑tRNA‑Synthetase, die Glycin an die passende tRNA koppelt und so die Genauigkeit der Translation sicherstellt. Über ihre essenzielle Funktion beim Beladen der tRNA unterstützt GlyRS die globale Proteinsynthese, die Proteostase sowie zelluläre Stressantworten, die mit dem Translationsbedarf verknüpft sind. Eine Störung der tRNA‑Synthetase‑Aktivität ist mit neuromuskulären und peripheren Nerven‑Phänotypen assoziiert, wodurch GARS ein nützlicher Ansatzpunkt zur Untersuchung von Mechanismen ist, die die Translationskontrolle mit der Aufrechterhaltung neuronaler Funktionen verbinden. Expression und Funktion von GARS sind zudem relevant für die mitochondrien‑zytosolische Koordination der Protein‑Homöostase und die zelluläre Anpassung an metabolischen oder proteotoxischen Stress.

GlyRS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GARS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GlyRS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GARS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GARS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GlyRS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GARS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GlyRS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GlyRS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GARS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.