Plásmido CRISPR de Activación (h) GlyRS: sc-404105-ACT

GARS codifica la glicil‑ARNt sintetasa humana (GlyRS), una aminoacil‑ARNt sintetasa citosólica que une la glicina a su ARNt correspondiente para garantizar la fidelidad de la traducción. A través de su papel esencial en la carga del ARNt, GlyRS sostiene la síntesis global de proteínas, la proteostasis y las respuestas celulares al estrés vinculadas a la demanda de traducción. La alteración de la actividad de las ARNt sintetasas se asocia con fenotipos neuromusculares y de nervio periférico, lo que convierte a GARS en un punto de interés para estudiar mecanismos que conectan el control translacional con el mantenimiento neuronal. La expresión y función de GARS también son relevantes para la coordinación mitocondria–citosol de la homeostasis proteica y la adaptación celular al estrés metabólico o proteotóxico.

GlyRS El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GARS sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GlyRS El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GARS en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GARS, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GlyRS. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GARS y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GlyRS en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GlyRS en células tumorales con expresión de GARS silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.