Glutathione reductase CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420666-ACT

Das Mausgen **Gsr** kodiert die Glutathion-Reduktase, eine zytosolische, FAD-abhängige Oxidoreduktase, die mithilfe von NADPH reduziertes Glutathion (GSH) aus Glutathiondisulfid (GSSG) regeneriert. Durch die Aufrechterhaltung des zellulären GSH/GSSG-Verhältnisses unterstützt die Glutathion-Reduktase die Redoxhomöostase, begrenzt die Anreicherung reaktiver Sauerstoffspezies und puffert thiolabhängige Signalwege sowie die Proteinfaltung. Die Gsr-Aktivität ist mit dem Glutathionstoffwechsel, NADPH-bildenden Stoffwechselwegen wie dem Pentosephosphatweg und antioxidativen Netzwerken einschließlich Glutathionperoxidasen und Peroxiredoxinen verknüpft. Eine Fehlregulation dieser Achse wird häufig im Kontext oxidativstressassoziierter Phänotypen untersucht, darunter Entzündung, Stoffwechselstörungen und zelluläre Verletzungsmodelle mit Relevanz für Neurodegeneration.

Glutathione reductase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Gsr-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Glutathione reductase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Gsr-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Gsr-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Glutathione reductase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Gsr-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Glutathione reductase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Glutathione reductase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Gsr-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.