Glutathione reductase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417499-ACT

GSR kodiert die Glutathionreduktase, eine flavoproteinhaltige Oxidoreduktase, die die zelluläre Redoxhomöostase aufrechterhält, indem sie reduziertes Glutathion (GSH) aus oxidiertem Glutathion (GSSG) unter Verwendung von NADPH regeneriert. Diese Reaktion ist zentral für die antioxidative Abwehr, unterstützt die Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies und bewahrt das Thiol-Redoxgleichgewicht im Zytosol und in den Mitochondrien. Durch die Aufrechterhaltung GSH-abhängiger Signalwege wie der Aktivität der Glutathionperoxidase und des Xenobiotika-Stoffwechsels beeinflusst GSR die Mitochondrienfunktion, die Proteinfaltung und den Schutz vor oxidativen Schäden. Eine dysregulierte Glutathion-Rezyklierung und erhöhter oxidativer Stress stehen mit Mechanismen in Zusammenhang, die an Anämie, Neurodegeneration, metabolischer Dysfunktion und der Krebsbiologie beteiligt sind, wodurch GSR einen nützlichen Ansatzpunkt für die Untersuchung redoxgetriebener Phänotypen darstellt.

Glutathione reductase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GSR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Glutathione reductase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GSR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GSR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Glutathione reductase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GSR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Glutathione reductase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Glutathione reductase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GSR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.