GLCNE Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406100-ACT

O GNE humano codifica a enzima bifuncional UDP-GlcNAc 2-epimerase/N-acetilmanosamina quinase (GLCNE), que catalisa as etapas limitantes da velocidade na biossíntese do ácido siálico ao converter UDP-GlcNAc em ManNAc e fosforilar ManNAc em ManNAc-6-fosfato. Por meio do controle da produção de CMP–ácido siálico, a GLCNE influencia a sialilação de glicoproteínas e glicolipídios, afetando interações célula–célula, sinalização de receptores e a estabilidade de proteínas de membrana. Esse nó metabólico integra-se às vias da hexosamina e dos açúcares nucleotídicos, que moldam a remodelação de glicoconjugados no desenvolvimento e em processos relacionados à imunidade. Variações patogênicas em GNE estão associadas à miopatia por GNE e foram vinculadas a uma desregulação mais ampla de fenótipos celulares dependentes de glicosilação, relevantes para a biologia neuromuscular e para pesquisas em glicobiologia.

GLCNE O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GNE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GLCNE O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GNE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GNE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GLCNE. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GNE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GLCNE no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GLCNE em células tumorais com expressão de GNE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.