GIT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402136-ACT

Humanes GIT1 (G‑Protein‑gekoppelter Rezeptorkinase‑interagierendes Protein 1) ist ein mit ARF‑GTPase‑aktivierenden Proteinen assoziiertes Scaffold-Protein, das den Turnover fokaler Adhäsionen, den Rezeptortransport (Trafficking) und das Remodeling des Aktinzytoskeletts koordiniert. Durch Interaktionen mit Proteinen wie GRKs, Paxillin sowie Komponenten endozytotischer und Adhäsionskomplexe trägt GIT1 dazu bei, Signale von GPCRs und Rezeptor‑Tyrosinkinasen in Signalwege zu integrieren, die Migration, Lamellipodien‑Dynamik und synaptische/neuronal-organisatorische Prozesse steuern. GIT1‑vermittelte Signalgebung wurde u. a. im Kontext invasiven Zellverhaltens, angiogener und vaskulärer Antworten sowie neurodevelopmentaler Prozesse untersucht, in denen Adhäsions- und Zytoskelettregulation entscheidend sind. Eine dysregulierte Expression oder veränderte Netzwerk‑Konnektivität von GIT1 ist daher für mechanistische Forschung zur Motilität von Krebszellen, zum Crosstalk entzündlicher Signalwege und zu neurologischen Phänotypen relevant.

GIT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GIT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GIT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GIT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GIT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GIT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GIT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GIT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GIT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GIT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.