Plasmide CRISPR d'Activation (h) GCP2: sc-404751-ACT

TUBGCP2 code pour GCP2, un composant central du complexe en anneau de la γ-tubuline (γTuRC), qui initie la nucléation des microtubules au niveau des centrosomes et d’autres centres organisateurs des microtubules. En soutenant l’assemblage du fuseau mitotique, l’intégrité du centrosome et la ségrégation correcte des chromosomes, GCP2 contribue à la progression du cycle cellulaire et au maintien de la stabilité du génome. Une perturbation de la fonction du γTuRC peut dérégler la dynamique des microtubules et accroître le stress mitotique, des processus fréquemment étudiés dans les travaux sur l’aneuploïdie et la dérégulation de la prolifération. Ainsi, TUBGCP2 est pertinent pour la recherche sur les mécanismes pathologiques liés au centrosome et la signalisation dépendante des microtubules dans les cellules humaines.

GCP2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TUBGCP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GCP2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TUBGCP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TUBGCP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GCP2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TUBGCP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GCP2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GCP2 dans les cellules tumorales présentant une expression de TUBGCP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.