Plásmido CRISPR de Activación (h) GalNAc-T3: sc-407682-ACT

GALNT3 codifica la polipeptídica N-acetilgalactosaminiltransferasa 3 (GalNAc-T3), una enzima iniciadora residente del aparato de Golgi para la glicosilación O unida de tipo mucina, que transfiere GalNAc a residuos de serina/treonina en proteínas secretadas y de membrana. Al determinar los sitios de inicio de los O-glicanos, GalNAc-T3 influye en el plegamiento y el tráfico de proteínas, su susceptibilidad a proteasas y la función de receptores y moléculas de adhesión a lo largo de vías epiteliales y secretoras. La alteración de la actividad de GALNT3 se ha relacionado con un procesamiento desregulado de glicoproteínas y con la señalización extracelular, con relevancia para trastornos de la homeostasis del fosfato y para un espectro más amplio de fenotipos asociados a la glicosilación. Por ello, la modulación de GalNAc-T3 resulta útil para dilucidar cómo la O-glicosilación controla las interacciones célula–célula, los programas de secreción y la comunicación ligando–receptor.

GalNAc-T3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GALNT3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GalNAc-T3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GALNT3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GALNT3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GalNAc-T3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GALNT3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GalNAc-T3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GalNAc-T3 en células tumorales con expresión de GALNT3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.