GADD 45γ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402483-ACT

GADD45G (GADD45γ) ist ein stressresponsives Mitglied der GADD45-Familie, das genotoxische und entzündliche Signale mit der Kontrolle von Zellzyklus-Checkpoints, der DNA-Reparatur-Signalgebung und der Apoptose verknüpft. Es ist an Signalwegen beteiligt, die sich um die MAPK-Signalgebung, p53-abhängige Stressantworten sowie die Modulation der CDK-Aktivität drehen, um bei zellulären Schäden oder im Rahmen von Differenzierungsprogrammen einen Wachstumsstopp durchzusetzen. Über diese Funktionen trägt GADD45γ zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität sowie zur Regulation von Immun- und hämatopoetischen Zellzuständen bei. Eine veränderte GADD45G-Expression wird mit dysregulierter Proliferation, aberranter Stress-Signalgebung und epigenetischen Stilllegungsmustern in Zusammenhang gebracht, die in unterschiedlichen malignen Kontexten beschrieben wurden, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien tumorsuppressiver Netzwerke macht.

GADD 45γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GADD45G-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GADD 45γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GADD45G-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GADD45G-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GADD 45γ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GADD45G-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GADD 45γ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GADD 45γ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GADD45G-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.