Plasmide CRISPR d'Activation (h) GABARAPL2: sc-403558-ACT

GABARAPL2 (protéine apparentée à la protéine associée au récepteur GABA de type A 2) est une protéine de la famille ATG8, de type ubiquitine-like, qui subit une lipidation et s’incorpore aux membranes des autophagosomes, où elle soutient la reconnaissance des cargos, l’élongation des vésicules et la maturation des autophagosomes. Elle contribue à des programmes d’autophagie sélective, notamment la mitophagie et l’agréphagie, via des interactions avec des adaptateurs contenant une région d’interaction avec LC3 (LIR) et avec des régulateurs du trafic membranaire. En reliant l’autophagie à la dynamique du système endomembranaire, GABARAPL2 influence la protéostasie cellulaire et les voies d’adaptation au stress telles que la détection des nutriments et le renouvellement lysosomal. Une autophagie dérégulée et une activité anormale du réseau ATG8 sont largement impliquées dans les maladies neurodégénératives, la biologie du cancer, les infections et la signalisation inflammatoire, faisant de GABARAPL2 un nœud utile pour des études mécanistiques dans ces contextes.

GABARAPL2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GABARAPL2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GABARAPL2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GABARAPL2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GABARAPL2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GABARAPL2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GABARAPL2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GABARAPL2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GABARAPL2 dans les cellules tumorales présentant une expression de GABARAPL2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.