Plasmide CRISPR d'Activation (h2) FXYD3: sc-406431-ACT-2

Le gène humain FXYD3 code une petite protéine régulatrice membranaire à passage unique de la Na⁺/K⁺‑ATPase, modulant la cinétique de la pompe et influençant ainsi l’homéostasie ionique cellulaire, le potentiel de membrane et la régulation du volume dans des contextes épithéliaux. En contrôlant le transport du sodium et du potassium, FXYD3 affecte des processus en aval liés à la prolifération, à la différenciation et à l’adaptation au stress, qui s’inscrivent dans des réseaux de signalisation sensibles à l’équilibre ionique. Une expression altérée de FXYD3 a été rapportée dans de nombreux carcinomes ainsi que dans d’autres pathologies épithéliales, ce qui souligne son intérêt pour l’étude des dérégulations de la biologie du transport et des modifications métaboliques et microenvironnementales associées aux tumeurs. L’édition du gène ou la perturbation de FXYD3 permet d’explorer les mécanismes de régulation de la Na⁺/K⁺‑ATPase, la protéostasie membranaire et des phénotypes dépendants des ions dans des modèles cellulaires humains, y compris via des essais fonctionnels de l’activité de la pompe, de la migration et des propriétés de barrière épithéliale.

FXYD3 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FXYD3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FXYD3 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FXYD3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FXYD3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FXYD3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FXYD3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FXYD3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FXYD3 dans les cellules tumorales présentant une expression de FXYD3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.