Fucokinase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409449-ACT

Das humane FUK-Gen kodiert die Fucokinase, eine zytosolische Kinase, die L‑Fucose zu Fucose‑1‑phosphat phosphoryliert und damit den L‑Fucose‑Salvage‑Weg einleitet, der GDP‑Fucose für Fucosylierungsreaktionen wieder auffüllt. Durch die Aufrechterhaltung der Nukleotid‑Zucker‑Homöostase trägt die Fucokinase zu Golgi‑ und ER‑gekoppelten Glykosylierungsprozessen bei, die Proteinfaltung, Rezeptorsignalisierung und Zell‑Zell‑Interaktionen regulieren. Veränderungen im Fucose‑Stoffwechsel und eine dysregulierte Fucosylierung wurden mit Änderungen der Immunmodulation, Entzündung und tumorspezifischen Glykansignaturen in Verbindung gebracht, wodurch FUK ein nützlicher Knotenpunkt für die Untersuchung der glykometabolischen Kontrolle von Zellphänotypen ist. Eine experimentelle Modulation der FUK‑Expression kann helfen, zu klären, wie aus dem Salvage‑Weg stammende GDP‑Fucose das Remodeling von Glykoproteinen und Glykolipiden in Stress‑ und Differenzierungskontexten beeinflusst.

Fucokinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FUK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fucokinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FUK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FUK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fucokinase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FUK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fucokinase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fucokinase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FUK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.