Plásmido CRISPR de Activación (h) FKRP: sc-404396-ACT

FKRP codifica la proteína relacionada con fukutina, una glicosiltransferasa residente del aparato de Golgi necesaria para la modificación postraduccional de la α-distroglucana, un receptor clave que conecta la matriz extracelular con el complejo distrofina–glicoproteína. A través de su papel en la glicosilación O-manosilada, FKRP contribuye a la integridad de la membrana basal y a la estabilidad del sarcolema, influyendo en el mantenimiento de las fibras musculares y en la organización del tejido neuromuscular. La alteración de la glicosilación dependiente de FKRP compromete la unión de ligandos de la α-distroglucana y se asocia estrechamente con fenotipos de distroglicanopatía, incluidas la distrofia muscular de cinturas y subtipos de distrofia muscular congénita. Como nodo de vía que conecta la maquinaria de glicosilación con la señalización de la matriz extracelular, FKRP se estudia ampliamente en modelos de patología muscular y de comportamiento celular dependiente de la matriz.

FKRP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FKRP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FKRP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FKRP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FKRP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FKRP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FKRP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FKRP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FKRP en células tumorales con expresión de FKRP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.