Fis1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426020-ACT

Fis1 (Fission 1) kodiert ein Protein der äußeren Mitochondrienmembran, das als Adapter für die DRP1-abhängige mitochondriale Spaltung (Fission) fungiert und die Architektur des mitochondrialen Netzwerks in Abhängigkeit vom Stoffwechselzustand und zellulärem Stress formt. Indem Fis1 die mitochondriale Teilung mit der Verteilung der Organellen, der Mitophagie und der Apoptose-Signalgebung koordiniert, beeinflusst es die bioenergetische Homöostase und den Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies. Ein gestörtes Gleichgewicht zwischen Fission und Fusion unter Beteiligung von Fis1 wird in der biomedizinischen Forschung mit beeinträchtigter mitochondrialer Qualitätskontrolle und zellulären Funktionsstörungen in Kontexten wie Neurodegeneration, kardiometabolischem Stress und Entzündung in Verbindung gebracht. Maus-Fis1 wird daher häufig eingesetzt, um Signalwege der mitochondrialen Dynamik und deren nachgeschaltete Auswirkungen auf Entscheidungen über das Zellschicksal zu untersuchen.

Fis1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Fis1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fis1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Fis1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Fis1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fis1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Fis1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fis1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fis1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Fis1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.