Filamin 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400557-ACT

FLNA kodiert Filamin A, ein großes aktinbindendes Gerüstprotein, das F‑Aktin quervernetzt und die Assemblierung mechanosensitiver Signalkomplexe an der Plasmamembran sowie entlang des Zytoskeletts koordiniert. Filamin A integriert Signale von Integrinen, GTPasen der Rho‑Familie und rezeptorassoziierten Signalwegen, um Zellform, Migration, Adhäsionsdynamik und Membrantransport zu regulieren. Über Interaktionen mit Ionenkanälen, GPCRs und Signaladaptern beeinflusst es den Umbau des Zytoskeletts und transkriptionelle Antworten auf mechanischen Stress. Eine Fehlregulation oder Mutation von FLNA ist mit Entwicklungsstörungen assoziiert und trägt zu veränderter Zellmotilität und Gewebearchitektur bei, was für neurovaskuläre und Bindegewebsphänotypen relevant ist.

Filamin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FLNA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Filamin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FLNA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FLNA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Filamin 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FLNA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Filamin 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Filamin 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FLNA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.