Plásmido CRISPR de Activación (h) Fibrillarin: sc-400741-ACT

FBL codifica la fibrilarina, una metiltransferasa nucleolar esencial que cataliza la metilación 2′-O de la ribosa del pre-rRNA dentro de complejos snoRNP de caja C/D, lo que favorece un procesamiento correcto del rRNA y la biogénesis de ribosomas. A través de sus funciones en la organización del nucléolo y en la coordinación de la modificación del RNA con la capacidad transcripcional y traduccional, la fibrilarina contribuye a programas fundamentales de proteostasis y crecimiento celular. La actividad nucleolar alterada y la producción desregulada de ribosomas —procesos en los que FBL es un componente central— se asocian con frecuencia a respuestas al estrés oncogénico y a otras enfermedades caracterizadas por un metabolismo del RNA alterado. Como nodo conservado en las vías de procesamiento de RNA, FBL se utiliza ampliamente como marcador y como punto de entrada mecanístico para estudiar la función nucleolar y el ensamblaje de ribonucleoproteínas.

Fibrillarin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FBL sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Fibrillarin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FBL en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FBL, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Fibrillarin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FBL y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Fibrillarin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Fibrillarin en células tumorales con expresión de FBL silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.