Plasmide CRISPR d'Activation (m) FAM20A: sc-431579-ACT

Fam20a code pour FAM20A, une protéine de la voie sécrétoire localisée dans l’appareil de Golgi, qui agit comme une pseudokinase et comme partenaire régulateur de la kinase FAM20C, influençant la phosphorylation des protéines extracellulaires et sécrétées. Par ce rôle, FAM20A contribue à coordonner la maturation des protéines et les programmes liés à la minéralisation dans les tissus associés à l’émail et à l’os, établissant un lien entre le trafic golgien et la maturation de la matrice extracellulaire. La perturbation de l’activité de FAM20A a été associée à des défauts de biomineralisation et à des phénotypes de calcification ectopique, ce qui la rend pertinente pour les études de biologie squelettique et de développement dentaire. Dans les systèmes murins, Fam20a constitue donc un outil utile pour étudier le contrôle, par la voie sécrétoire, de la phosphorylation des protéines extracellulaires et de l’homéostasie de la matrice.

FAM20A Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Fam20a sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FAM20A Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Fam20a dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Fam20a, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FAM20A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Fam20a natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FAM20A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FAM20A dans les cellules tumorales présentant une expression de Fam20a silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.