Factor X CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404175-ACT

Das humane F10-Gen kodiert den Gerinnungsfaktor X, ein Vitamin-K-abhängiges Serinprotease-Zymogen, das hauptsächlich in Hepatozyten gebildet und ins Plasma sezerniert wird. Nach der Aktivierung zu Faktor Xa durch die intrinsischen und extrinsischen Tenase-Komplexe bildet Faktor Xa zusammen mit Faktor Va auf Phospholipidoberflächen den Prothrombinase-Komplex, der Prothrombin zu Thrombin umwandelt und dadurch die Fibrinbildung sowie die thrombozytengetriebene Hämostase verstärkt. Dieser zentrale Knotenpunkt integriert gewebefaktorinitiierte Signalgebung, die calcium- und membranabhängige Assemblierung von Gerinnungskomplexen und die Regulation durch Proteaseinhibitoren innerhalb der Gerinnungskaskade. Eine dysregulierte F10-Expression oder -Aktivität ist mit Blutungsphänotypen assoziiert und trägt zur Biologie der Thrombose bei, was F10 für die Untersuchung der Dynamik der Gerinnungswege, der hepatischen Genregulation und des Crosstalks von Proteasenetzwerken relevant macht.

Factor X Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen F10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Factor X Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des F10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der F10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Factor X-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native F10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Factor X-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Factor X-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem F10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.