Factor B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402091-ACT

O fator do complemento B (CFB) codifica o Fator B, um zimogénio central de serina protease da via alternativa do complemento, que se associa ao C3b para formar a proconvertase e, após clivagem pelo Fator D, a convertase de C3 (C3bBb). Este complexo enzimático amplifica a ativação do complemento, promovendo a opsonização, a sinalização inflamatória via anafilatoxinas e, a jusante, a formação do complexo de ataque à membrana. A atividade do Fator B é rigorosamente regulada por inibidores do complemento para equilibrar a defesa do hospedeiro com a prevenção de lesão colateral. A ativação desregulada da via alternativa e a variação genética em CFB estão associadas a condições inflamatórias e degenerativas mediadas pelo complemento, sustentando a sua utilização como um nó mecanístico na investigação da imunidade inata.

Factor B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CFB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Factor B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CFB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CFB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Factor B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CFB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Factor B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Factor B em células tumorais com expressão de CFB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.