Plásmido CRISPR de Activación (h) FACE-1: sc-403350-ACT

El ZMPSTE24 humano codifica FACE-1, una metaloproteasa de zinc incrustada en la membrana del retículo endoplásmico que cataliza pasos proteolíticos clave en la maduración de la prelamina A. Al escindir el extremo C-terminal farnesilado de la prelamina A, FACE-1 favorece el ensamblaje adecuado de la lámina nuclear, la morfología nuclear y la organización de la cromatina, vinculando su actividad con la estabilidad del genoma y la regulación del ciclo celular. La alteración del procesamiento dependiente de ZMPSTE24 promueve la acumulación de intermediarios tóxicos de prelamina A y una mecanotransducción alterada, conectando esta vía con fenotipos de envejecimiento prematuro y estados de estrés celular asociados a laminopatías. La función de FACE-1 también es relevante para la proteostasis más amplia de la membrana del RE y para las redes de procesamiento de proteínas modificadas por lípidos que influyen en la integridad de la envoltura nuclear.

FACE-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ZMPSTE24 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FACE-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ZMPSTE24 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ZMPSTE24, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FACE-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ZMPSTE24 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FACE-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FACE-1 en células tumorales con expresión de ZMPSTE24 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.