EYA1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420254-ACT

Eya1 kodiert den transkriptionellen Koaktivator und die Tyrosinphosphatase EYA1, einen zentralen Regulator der Organogenese und von Zellschicksalsentscheidungen während der Mausentwicklung. EYA1 wirkt in nukleären Transkriptionsprogrammen zusammen mit SIX- und DACH-Faktoren und ist zudem an phosphorylierungsabhängiger Signalübertragung beteiligt, die Proliferation, Überleben und Differenzierung beeinflusst. Seine Aktivität ist eng mit Entwicklungswegen verknüpft, die die Bildung von Sinnesorganen, die Nephrogenese und die kraniofaziale Musterbildung steuern, weshalb Eya1 häufig als Modellgen für die Untersuchung genregulatorischer Netzwerke verwendet wird. Eine veränderte Eya1-Dosierung oder -Regulation ist mit kongenitalen Entwicklungsphänotypen assoziiert und bietet einen mechanistischen Ansatzpunkt, um die transkriptions- und phosphataseabhängige Kontrolle der Morphogenese zu untersuchen.

EYA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Eya1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EYA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Eya1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Eya1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EYA1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Eya1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EYA1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EYA1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Eya1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.