EXT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404635-ACT

Das menschliche **EXT1** kodiert **Exostosin-1**, eine im Golgi-Apparat lokalisierte Glykosyltransferase, die mit **EXT2** einen funktionellen Komplex bildet, um die Verlängerung von **Heparansulfatketten** auf Proteoglykanen zu katalysieren. Durch die Kontrolle der Heparansulfat-Biosynthese prägt EXT1 die Organisation der extrazellulären Matrix und moduliert die Ligandenverfügbarkeit für zentrale Signalwege, darunter **FGF**, **WNT**, **Hedgehog** und **BMP**, und beeinflusst damit Zelladhäsion, Migration und die Musterbildung während der Entwicklung. Eine Störung oder Fehlregulation von EXT1 verändert die Proteoglykanzusammensetzung und Signalmorphogengradienten und ist eng mit Skelettdysplasien wie **multiplen Osteochondromen** sowie allgemeineren Defekten der Gewebemorphogenese verknüpft. Die Aktivität von EXT1 ist zudem relevant für Untersuchungen zur Umgestaltung des Tumormikromilieus und zu Rezeptor-Ligand-Interaktionen, die von der Präsentation von Heparansulfat abhängen.

EXT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EXT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EXT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EXT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EXT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EXT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EXT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EXT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EXT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EXT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.