Plasmide CRISPR d'Activation (h) ENT4: sc-405115-ACT

Le gène humain SLC29A4 code le transporteur nucléosidique équilibratif 4 (ENT4), un transporteur de la membrane plasmique qui facilite le flux bidirectionnel de l’adénosine et de nucléosides apparentés, dont l’activité de transport est influencée par le pH extracellulaire. En modulant la disponibilité des nucléosides, ENT4 peut affecter le métabolisme de sauvetage des purines ainsi que les réseaux de signalisation de l’adénosine extracellulaire, qui façonnent les réponses cellulaires au stress et les signaux inflammatoires. L’activité d’ENT4 a été étudiée dans des contextes où l’homéostasie de l’adénosine est perturbée, notamment dans des processus cardiométaboliques et neurobiologiques. Une expression altérée de SLC29A4 est également pertinente pour des études portant sur des phénotypes monoaminergiques et liés aux nucléosides, ce qui soutient son utilisation comme cible pour la cartographie de voies et la génomique fonctionnelle.

ENT4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC29A4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ENT4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC29A4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC29A4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ENT4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC29A4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ENT4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ENT4 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC29A4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.