EN1/Engrailed 1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420171-ACT

Das murine En1-Gen kodiert EN1/Engrailed 1, einen Homeobox-Transkriptionsfaktor, der während der Embryonalentwicklung die Positionsidentität festlegt und Musterbildungsprogramme reguliert, mit zentralen Funktionen bei der Ausbildung der Mittelhirn–Hinterhirn-Grenze und der Morphogenese des Kleinhirns. EN1 moduliert Genexpressionsnetzwerke, die die neuronale Spezifikation, Axonführung und regionale Differenzierung steuern, und interagiert dabei mit entwicklungsbiologischen Signalachsen wie Wnt, FGF, BMP und SHH, die Schicksalsentscheidungen im Neuroepithel koordinieren. In postnatalen Geweben trägt EN1 zur Aufrechterhaltung von Neuronen und zur Funktion neuronaler Schaltkreise bei und ist damit relevant für Studien zu neurodevelopmentalen Phänotypen, neuronaler Vulnerabilität und transkriptioneller Dysregulation. Eine veränderte EN1-Expression wurde in Modellen für Entwicklungsfehlbildungen sowie in Kontexten untersucht, in denen linienbestimmende Transkriptionsfaktoren in krankheitsassoziierten genregulatorischen Programmen zweckentfremdet werden.

EN1/Engrailed 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen En1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EN1/Engrailed 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des En1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der En1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EN1/Engrailed 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native En1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EN1/Engrailed 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EN1/Engrailed 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem En1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.