eIF2C3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401908-ACT

O AGO3 humano (eIF2C3) codifica uma proteína da família Argonaute que atua como componente central do complexo de silenciamento induzido por RNA, acoplando pequenos RNAs à repressão específica por sequência de transcritos-alvo. Por meio de interações com miRNAs e outros pequenos RNAs, o eIF2C3 contribui para a regulação gênica pós-transcricional que molda transições de estado celular, respostas ao estresse e o controle, em nível de rede, de programas de expressão gênica. Vias dependentes de Argonaute interagem com a regulação da cromatina e com o reconhecimento imune inato de ácidos nucleicos, influenciando vias relevantes para proliferação, diferenciação e homeostase tecidual. A atividade desregulada de pequenos RNAs/Argonaute tem sido associada a alterações na regulação do transcriptoma na biologia do câncer e em outras doenças complexas nas quais redes de miRNAs estão perturbadas.

eIF2C3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AGO3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

eIF2C3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AGO3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AGO3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de eIF2C3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AGO3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de eIF2C3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via eIF2C3 em células tumorais com expressão de AGO3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.