Plasmide CRISPR d'Activation (h) EHD2: sc-403776-ACT

EHD2 (EH domain containing 2) est une ATPase apparentée à la dynamine qui s’associe aux cavéoles et au cytosquelette d’actine cortical afin de réguler la courbure membranaire, le trafic endocytaire et la stabilité des cavéoles. En contraignant la dynamique des cavéoles et en influençant la scission et le recyclage des vésicules, EHD2 contribue aux voies de mécanotransduction et de gestion des lipides qui façonnent l’adhérence cellulaire, la migration et les réponses à la tension membranaire. Dans la littérature, un trafic cavéolaire dérégulé et un couplage au cytosquelette impliquant EHD2 ont été associés à une altération de l’homéostasie métabolique et à des phénotypes oncogéniques, notamment des changements de l’invasivité cellulaire et de la compartimentation des voies de signalisation. Par conséquent, EHD2 est fréquemment étudiée dans des travaux sur l’endocytose, l’organisation de la membrane plasmique et la signalisation dépendante des cavéoles dans les cellules humaines.

EHD2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EHD2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EHD2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EHD2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EHD2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EHD2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EHD2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EHD2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EHD2 dans les cellules tumorales présentant une expression de EHD2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.