EDD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402123-ACT

UBR5 kodiert das humane EDD-Protein, eine HECT-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die den Proteinumsatz und Signalwege durch gezielte Ubiquitinierung reguliert. EDD ist an Programmen zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt, indem es die Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden koordiniert, die Checkpoint-Kontrolle moduliert und transkriptionelle Antworten auf zellulären Stress mitprägt. Über diese Funktionen beeinflusst es die Zellzyklusprogression, die Toleranz gegenüber Replikationsstress sowie Proteostasewege, die mit der Dynamik des Ubiquitin-Proteasom-Systems verknüpft sind. Eine fehlregulierte UBR5/EDD-Aktivität und Veränderungen der Kopienzahl wurden mit veränderten onkogenen Signalnetzwerken und einer aberranten DNA-Reparaturkapazität in Verbindung gebracht, was seinen Einsatz als mechanistischer Knotenpunkt in Studien zur Tumorbiologie und stressadaptiven Transkription stützt.

EDD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBR5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EDD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBR5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBR5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EDD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBR5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EDD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EDD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBR5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.