Plasmide CRISPR d'Activation (h) EB1: sc-401367-ACT

Le gène humain MAPRE1 code la protéine 1 se liant aux extrémités (EB1), un facteur central de suivi des extrémités « plus » des microtubules, qui coordonne la dynamique des microtubules avec la capture corticale, l’assemblage du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes. EB1 interagit avec APC et d’autres protéines +TIP pour réguler la croissance des microtubules, la polarité cellulaire et le transport intracellulaire, reliant le remodelage du cytosquelette au contrôle du cycle cellulaire. La dérégulation de MAPRE1/EB1 a été associée à une altération de la fidélité mitotique, à l’aneuploïdie et à un comportement cellulaire invasif, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des voies sous-jacentes aux phénotypes prolifératifs et migratoires. Son rôle central dans les processus dépendants des microtubules soutient également les recherches mécanistiques sur la fonction du centrosome et la régulation du point de contrôle du fuseau.

EB1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAPRE1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EB1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAPRE1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAPRE1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EB1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAPRE1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EB1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EB1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MAPRE1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.