dystrophin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420021-ACT

Dmd codifica a distrofina, uma grande proteína do citoesqueleto que liga a rede de actina ao complexo distrofina–glicoproteína no sarcolema, sustentando a estabilidade da membrana durante a contração muscular. No músculo esquelético e cardíaco de camundongos, a distrofina contribui para a mecanotransdução, a organização dos costâmeros e a manutenção da homeostase do cálcio, com efeitos a jusante sobre vias de inflamação e de remodelamento fibrótico quando sua expressão é reduzida. A disrupção ou a diminuição da função da distrofina está associada a dano progressivo das miofibras e comprometimento da integridade muscular, tornando Dmd um gene central para o estudo de fenótipos de degeneração muscular. Processos dependentes de Dmd também são relevantes para modelar alterações na sinalização da matriz extracelular, respostas ao estresse e programas transcricionais mionucleares em contextos de doenças neuromusculares.

dystrophin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Dmd sem alterar a sequência de ADN subjacente.

dystrophin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Dmd em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Dmd, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de dystrophin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Dmd nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de dystrophin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via dystrophin em células tumorais com expressão de Dmd silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.