Plasmide CRISPR d'Activation (m) dystrophin: sc-420021-ACT

Dmd code la dystrophine, une grande protéine du cytosquelette qui relie le réseau d’actine au complexe dystrophine–glycoprotéines au niveau du sarcolemme, contribuant à la stabilité membranaire lors de la contraction musculaire. Dans les muscles squelettiques et cardiaques de la souris, la dystrophine participe à la mécanotransduction, à l’organisation des costamères et au maintien de l’homéostasie calcique, avec des effets en aval sur les voies de l’inflammation et du remodelage fibrotique lorsque son expression est réduite. La perturbation ou la diminution de la fonction de la dystrophine est associée à des lésions progressives des myofibres et à une altération de l’intégrité musculaire, faisant de Dmd un gène central pour l’étude des phénotypes de dégénérescence musculaire. Les processus dépendants de Dmd sont également pertinents pour modéliser des modifications de la signalisation de la matrice extracellulaire, des réponses au stress et des programmes transcriptionnels myonucléaires dans des contextes de maladies neuromusculaires.

dystrophin Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Dmd sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

dystrophin Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Dmd dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Dmd, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de dystrophin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Dmd natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de dystrophin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie dystrophin dans les cellules tumorales présentant une expression de Dmd silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.