DRP1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428678-ACT

Das murine Dnm1l kodiert das dynaminverwandte Protein 1 (DRP1), eine große GTPase, die die Spaltung (Fission) von Mitochondrien und Peroxisomen steuert, indem sie sich an Organellmembranen assembliert und diese auf GTP-abhängige Weise einschnürt. DRP1 integriert Signale aus Phosphorylierung, SUMOylierung und Ubiquitinierung, um die Fissionsdynamik mit dem zellulären Energiestatus, der Ca2+-Homöostase und dem Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies zu koppeln. Über seine zentrale Rolle beim Umbau des mitochondrialen Netzwerks beeinflusst DRP1 die Mitophagie, die Apoptose-Empfindlichkeit und die Progression des Zellzyklus, wodurch die Regulation von Dnm1l für Studien zu Neurodegeneration, kardiometabolischem Stress, Entzündung und der Anpassung von Krebszellen hochrelevant ist. Störungen der DRP1-Aktivität werden häufig mit veränderter Bioenergetik und Organell-Qualitätskontrollwegen in Verbindung gebracht, einschließlich PINK1/Parkin-assoziierter Mitophagie und stressaktivierter Kinase-Signalwege.

DRP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Dnm1l-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DRP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Dnm1l-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Dnm1l-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DRP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Dnm1l-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DRP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DRP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Dnm1l-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.