Plásmido CRISPR de Activación (h) DPYD: sc-403396-ACT

El DPYD humano codifica la dihidropirimidina deshidrogenasa, una flavoproteína citosólica que cataliza la reducción limitante de la velocidad de uracilo y timina, iniciando el catabolismo de las pirimidinas. Al controlar el recambio de pirimidinas, DPYD influye en la homeostasis de nucleótidos, el equilibrio de precursores de ARN/ADN y las respuestas celulares al estrés metabólico. La actividad alterada de DPYD se ha asociado con errores congénitos del metabolismo de las pirimidinas y con la variabilidad en el manejo de las fluoropirimidinas, vinculando esta vía con contextos de investigación neurodel desarrollo y farmacogenómica. Por ello, DPYD es un nodo útil para estudiar la regulación metabólica, la bioquímica redox y los efectos a nivel de vía sobre la proliferación y la aptitud celular.

DPYD El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DPYD sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DPYD El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DPYD en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DPYD, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DPYD. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DPYD y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DPYD en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DPYD en células tumorales con expresión de DPYD silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.