DP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403331-ACT

Human TFDP1 kodiert DP-1, einen sequenzspezifischen Transkriptionsfaktor, der mit Mitgliedern der E2F-Familie heterodimerisiert und so Gene reguliert, die für den G1/S-Übergang, die DNA-Replikation und das Fortschreiten der Mitose erforderlich sind. DP-1/E2F-Komplexe integrieren Signale aus dem RB-Signalweg, um den Eintritt in den Zellzyklus, die Checkpoint-Kontrolle und proliferationsassoziierte Transkriptionsprogramme zu koordinieren. Durch die Kontrolle der Replikationslizenzierung und der Genexpression in der S-Phase beeinflusst die TFDP1-Aktivität die Genomstabilität und zelluläre Antworten auf onkogenen Stress. Eine Fehlregulation der TFDP1–E2F-Signalgebung ist häufig an der Biologie proliferationsgetriebener Erkrankungen beteiligt, wodurch DP-1 ein nützlicher Knotenpunkt für die Untersuchung der Zellzykluskontrolle, von DNA-Schadensantworten und der Umverdrahtung transkriptioneller Netzwerke in menschlichen Zellen ist.

DP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TFDP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TFDP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TFDP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TFDP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TFDP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.