Plásmido CRISPR de Activación (h) Dnmt2: sc-402709-ACT

TRDMT1 codifica Dnmt2, una metiltransferasa de citosina-5 conservada evolutivamente que metila principalmente ARNt específicos, en particular el ARNtAsp, para favorecer la estabilidad del ARN y la proteostasis bajo estrés celular. Mediante la metilación de ARN, Dnmt2 contribuye a la fidelidad de la traducción, a la señalización de respuesta al estrés y al mantenimiento de la regulación epitranscriptómica, que puede influir en programas de crecimiento y diferenciación celular. La actividad alterada de TRDMT1 se ha vinculado a cambios en los patrones de modificación del ARN asociados con la estabilidad genómica, la apoptosis y la susceptibilidad al daño inducido por el estrés. La desregulación de estos procesos es relevante para estudios mecanísticos de la biología del cáncer, la neurobiología y la señalización inflamatoria, donde la modificación del ARN y el control de la traducción se alteran con frecuencia.

Dnmt2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TRDMT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Dnmt2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TRDMT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TRDMT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Dnmt2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TRDMT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Dnmt2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Dnmt2 en células tumorales con expresión de TRDMT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.