Dkk-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406386-ACT

Das humane DKK4 kodiert das Dickkopf-verwandte Protein 4 (Dkk-4), einen sezernierten Modulator der Wnt-Signalübertragung, der die β‑Catenin‑abhängige Transkription und nachgeschaltete Programme steuert, die Proliferation, Differenzierung und die Organisation epithelialer Gewebe kontrollieren. Durch die Interaktion mit Wnt‑Korezeptoren und die Feinabstimmung der Signalstärke kann Dkk‑4 Zellschicksalsentscheidungen sowie Umbau- und Remodelling‑Antworten in Entwicklungs- und adulten Kontexten beeinflussen. Eine fehlregulierte DKK4-Expression wurde in mehreren krankheitsrelevanten Situationen mit veränderter Wnt‑Pathway‑Aktivität in Verbindung gebracht, darunter Tumorbiologie und Gewebefibrose, wo Verschiebungen im Signaling‑Gleichgewicht Invasion, stammzellähnliche Phänotypen und Interaktionen mit dem Mikromilieu beeinflussen. Als Knotenpunkt des Signalwegs wird DKK4 häufig im Hinblick auf seine Rolle in der Signalweg‑Kreuzkopplung mit Wachstumsfaktorsignalen und die Regulation extrazellulärer Signaling‑Gradienten untersucht.

Dkk-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DKK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dkk-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DKK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DKK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dkk-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DKK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dkk-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dkk-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DKK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.