Dhh CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403357-ACT

Das menschliche DHH-Gen kodiert Desert hedgehog (Dhh), ein sezerniertes Morphogen aus der Hedgehog-Familie, das über den kanonischen PTCH1–SMO-Signalweg und nachgeschaltete GLI-Transkriptionsfaktoren die Festlegung von Zellschicksalen und die Gewebemusterbildung reguliert. Dhh ist insbesondere für die Entwicklung peripherer Nerven und die Gonadendifferenzierung wichtig, indem es die Reifung der Schwannzell-Linie und die Funktion somatischer Zellen des Hodens koordiniert. Eine veränderte DHH-Expression oder Signalwegaktivität wurde mit Störungen der Geschlechtsentwicklung sowie mit peripher-neuropathieassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht; daher wird Dhh häufig als kontextabhängiger Regulator entwicklungsbiologischer Signalprogramme untersucht. Als ligandengetriebener Knotenpunkt des Signalwegs bietet Dhh einen gut zugänglichen Ansatzpunkt, um parakrine Kommunikation, Morphogengradienten und transkriptionelle Antworten in Stammzell-, Organoid- und entwicklungsbiologischen Modellsystemen zu analysieren.

Dhh Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DHH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dhh Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DHH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DHH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dhh-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DHH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dhh-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dhh-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DHH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.