Plasmide CRISPR d'Activation (h) DGK-κ: sc-410308-ACT

DGKK code la diacylglycérol kinase kappa (DGK-κ), une kinase lipidique qui phosphoryle le diacylglycérol afin de produire de l’acide phosphatidique, modulant ainsi la dynamique des signaux de second messager. En contrôlant l’équilibre entre les effecteurs dépendants du DAG et ceux dépendants de l’AP, DGK-κ influence les voies de signalisation liées à la PKC et à Ras/MAPK, avec des répercussions en aval sur le trafic membranaire, le remodelage du cytosquelette et les programmes transcriptionnels. L’activité de DGKK a été associée à des processus cellulaires pertinents pour la fidélité de la transduction du signal dans des contextes immunitaires et épithéliaux, et les altérations de la signalisation de la famille des DGK sont fréquemment étudiées en lien avec une prolifération dérégulée et une signalisation inflammatoire. DGKK est également étudié pour sa contribution aux perturbations, associées aux maladies, des réseaux de signalisation lipidique, notamment des voies impliquées dans la signalisation oncogénique et la régulation immunitaire.

DGK-κ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DGKK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DGK-κ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DGKK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DGKK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DGK-κ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DGKK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DGK-κ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DGK-κ dans les cellules tumorales présentant une expression de DGKK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.